ISSN 2410-7751 (Друкована версія)
ISSN 2410-776X (Електронна версія)
Biotechnologia Acta Т. 15, № 5, 2022
С. 31-40. Бібліогр. 35, англ.
УДК 577.27:606.61:617.7
https://doi.org/10.15407/biotech15.05.031
А. Тихомиров1, О. Юсова1, Л. Капустяненко1, В. Білоус1, Т. Дроботько1, І. Гавриляк2, Н. Гребень2, Дж. А. Агджа3, 1
1Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ, Україна 2Національний медичний університет ім. О. О. Богомольця, Київ, Україна 3Бінгольський Університет, Бінгол, Туреччина
Лактоферин є мультифункціональним протеїном, що синтезується різними тканинами організму та володіє антимікробною та імуномодуляторною активністю. Лактоферин відіграє провідну роль у підтриманні нормального функціонування ока.
Метою роботи було отримати поліклональні антитіла до лактоферину людини для їхнього використання у визначенні вмісту лактоферину в слізній рідині, отриманої за норми та з очей з ушкодженою рогівкою.
Матеріали та методи. Фракцію імуноглобулінів G (IgG) було виділено з сироватки крові кролів, імунізованих лактоферином, за допомогою афінної хроматографії на протеїн А-сефарозі. Ступінь чистоти протеїну на кожній стадії очищення перевіряли за допомогою денатуруючого гель-електрофорезу (SDS-PAGE). Розпізнавання цільового антигену отриманими антитілами оцінювали за допомогою вестерн-блот аналізу з використанням розчину фракції IgG. Рівень лактоферину в слізній рідині, отриманої із здорового ока (n = 4) та з ока пацієнтів з непроникаючим пошкодженням рогівки (n = 6) визначали імунохімічно з використанням отриманих антитіл. Результати визначення вмісту лактоферину в сльозі за умов норми та за травмування рогівки аналізували з використанням U-тесту Манна-Уітні. Міжгрупова різниця вважалася статистично достовірною за Р<0,05.
Результати. Антитіла до лактоферину людини у вигляді фракції IgG було виділено на протеїн А-сефарозі з сироватки крові імунізованих кролів. Вестерн-блот аналізом було показано, що отримані антитіла розпізнають відповідний антиген як зону 75 kDa, яка відповідає за молекулярною масою інтактному поліпептиду лактоферину людини. Та ж сама поліпептидна зона була визначена вестерн-блотом з підсиленою хемілюмінісцентною детекцією у зразках слізної рідини. Денситометричний аналіз поліпептиду 75 kDa уможливив встановити, що вміст лактоферину в сльозі, зібраної в пацієнтів з непроникаючими травмами рогівки є у 3,2 рази нижчим за цей показник у нормі (P<0,05). Крім того, слізна рідина пацієнтів з пошкодженнями рогівки у значних кількостях містила також імунореактивні продукти розщеплення лактоферину, а також високомолекулярні поліпептиди, які можуть відповідати комплексам лактоферину з іншими протеїнами, що утворюються за розвитку запальних процесів.
Висновки. Згідно з наведеними даними, отримані антитіла до лактоферину можуть бути використані як корисний інструмент для створення удосконалених тестів та підходів для діагностики очних хвороб, пов’язаних з ушкодженням рогівки. Зниження вмісту лактоферину може слугувати прогностичним біомаркером перебігу ранового процесу в оці, зокрема, за непроникаючих травм рогівки, та є зручним до визначення в простий та неінвазійний спосіб.
Ключові слова: лактоферин, антитіла, вестерн блот аналіз, травми рогівки, слізна рідина
© Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, 2022